学位論文 遺伝様式の異なる核DNAとミトコンドリアDNAの情報を用いたニガクリタケ(モエギタケ科)の隠蔽種の認識

大田, 崚眞

pp.1 - 58 , 2017-03-25
内容記述
高等菌類(キノコ類)も含めて生物における種の分類は、一般的に形態学的差異に基づいて行われてきた。一方近年では、自然条件下で交配するかどうか、さらにその結果として生殖能力をもつ子孫を生じるかどうか、すなわち生殖的隔離の有無によって同種かどうかを判断する生物学的種分類がより望ましいと考えられるようになった。このような種の概念の変遷によって、これまで形態学的に同種とされてきた種の中に、生殖的隔離を有する別の生物学的種が含まれる場合が生じた。このような種のことを互いに「隠蔽種」と呼ぶ。高等菌類は、その生活環の中で最も大きくて体制が複雑な子実体(キノコ)でも形態的に非常に単純で、外見的な特徴に乏しいために隠蔽種が数多く存在すると考えられる。これらの隠蔽種を認識することは分類学的に重要であるのみならず、それぞれの種の生態学的特性を正しく理解する上でも重要である。様々な生物群で、隠蔽種間に生態的分化が見られる例が多く報告されているからである。ニガクリタケはハラタケ目モエギタケ科クリタケ属に属する木材腐朽菌類の一種であり、毒キノコとして有名である。北海道を除く日本全土をはじめ、中国・韓国・欧州・北米などに広く分布し、初夏から晩秋にかけて腐朽した木材や切り株の上にその子実体を発生させる。この種は形態ならびに生育環境が多様なため、複数の隠蔽種を含む可能性が高いと考えた。そこで本研究では、遺伝様式の異なる核とミトコンドリアのDNA情報を比較することによってニガクリタケの種内個体群間での生殖的隔離の有無を推定し、その結果に基づいて隠蔽種を探索することにした。さらに、そのようにして見出された隠蔽種の候補については、それらの間の子実体の形態や発生環境を詳しく比較することによって形態的・生態的な分化も検証した。本研究の材料としては、東京都を中心に国内の各地(東京都・神奈川県・千葉県・栃木県・山梨県・群馬県・長野県・山形県・京都府・滋賀県・大分県・鹿児島県)でニガクリタケの子実体サンプル採集を行い、採集日・採集場所・発生していた木材の特徴・周囲の環境・子実体の傘の大きさと色・柄の長さなどを記録した。次に子実体サンプルから全DNAを抽出し、ミトコンドリアDNAのcox3領域(単性遺伝、以降、mt cox3)と核リボソームDNAのITS領域(両性遺伝、以降、核ITS)の塩基配列を決定した。異なるDNAタイプの個体間で交配可能な(生殖的隔離が存在しない)場合は、ミトコンドリアDNAと核DNAで一致して支持されるDNAタイプが存在することはない。なぜなら、異なるDNAタイプをもつ個体同士で交配した場合、結果として生じる子実体の核DNAは2つのDNAタイプを合わせもち、ミトコンドリアDNAは片方の親のDNAタイプだけをもつためである。よって遺伝様式の異なる2つの領域を解析し、その解析結果における塩基配列(DNA)のタイプ分けが一致すれば、異なるDNAタイプをもつ個体間で遺伝子交流はなく、生殖的隔離が存在するといえる。さらに核ITSにおける解析では、実際に異なる塩基配列をヘテロにもつ個体が見られた。ヘテロ接合体が存在することは、それら2つの異なる配列が交配可能な同種内の変異であることを示唆する。そのためヘテロ接合体については、SSCP法を用いて2つの配列を分離してそれぞれの配列を決定し、これらの情報も総合して交配の有無を検証した。本研究では、異なる29地点から合計96個体のニガクリタケの子実体サンプルが得られた。これらのサンプルから得られた塩基配列について分子系統解析を行ったところ、ミトコンドリアDNAと核DNAの両方の領域において、それぞれ別のクレードを形成する2つのDNAタイプが認められた。さらにこれら2つのDNAタイプを構成する個体は両方の領域間で一致していた。さらに十分交配が起こりうると考えられる近い地理的距離の範囲内でも両方のDNAタイプのサンプルが採集されており、2つのDNAタイプの差異は単なる地理的変異によるものではない。また、核ITSのSSCP法による解析の結果、見出されたヘテロ接合体の大部分はそれぞれのDNAタイプ内の配列が組み合わさったもの、すなわちDNAタイプ内の交配によるものであった。このことから、それぞれのDNAタイプ内における交配は容易に起こることも示唆された。ただし、2つのサンプルについては、2つの核ITS DNAタイプの配列を合わせもっていた。この2つの子実体サンプルについて胞子稔性を調査したところ、胞子の形成に異常が見られ、生殖能力をもたない不稔雑種である可能性が示唆された。これらのことから、ニガクリタケにおいて、2つのDNAタイプ間には生殖的隔離が存在していると考えられる。これら2つのDNAタイプ間では、子実体の形態形質や発生環境についても差異が見られた。一方のタイプ(TypeA)に属する個体は、淡黄色から鮮やかな黄色の傘とくすんだ黄色いひだをもつ。それに対して、他方(TypeB)の個体は黄褐色の傘と黒紫色のひだをもつものが多く見られた。また、これらのタイプ間で、高等菌類の形態分類の際によく用いられている胞子の形状やシスチジア(担子器)を顕微鏡観察したところ、その形状にも違いが見られた。さらに、TypeAに属する個体は、腐朽の進んだ倒木や伐採された木材から発生しているのに対して、TypeBに属する個体は、切り株の根元や立ち枯れした木の根元など、あまり腐朽が進んでいない状態の木材から発生しているものが多かった。以上のことから、日本産ニガクリタケには生殖的隔離を有し、形態的・生態学的にも異なる少なくとも2つの隠蔽種が含まれていると結論付けた。
Species of higher fungi have traditionally been classified based on morphological differences. However, nowadays, it is considered more desirable to classify based on the biological species concept, or existence of reproductive isolation. In other words, it is more important to examine whether they are crossable under natural condition and can leave viable progeny. This change of view means that, some morphological species may contain several reproductively isolated species. These species are called as "cryptic species." Even fruit bodies (mushroom) which are the largest and most complex organ of higher fungi, they have simple morphology, and many cryptic species are expected to exist here. Recognition of cryptic species is important for taxonomy, as well as for accurate understanding of their ecology, because niche differentiation has repeatedly been reported among cryptic species. Hypholoma fasciculare Kummer is a wood-rotting-fungus belonging to Strophariaceae, Agaricales. It is also famous as a toxic mushroom. The fruit bodies of this species are found on stumps or rotten woods in Japan, China, Korea, Europe and North America from June to November. Because large morphological and ecological variations are observed in this species, I considered that H. fasciculare may include several cryptic species. So in this study, I at first estimated the existence of reproductive isolation within H. fasciculare by comparing nuclear and mitochondria DNA information which have different inheritances modes. In addition, I examined possible ecological and morphological differentiation among candidate cryptic species. I collected fruit body samples of H. fasciculare at several localities in Japan (Tokyo, Kanagawa, Chiba, Tochigi, Yamanashi, Gunma, Nagano, Yamagata, Kyoto, Shiga, Ooita and Kagoshima prefectures), and recorded date, locality, species of base wood, surrounding environments, size of pileus, color of fruit bodies, length of stalks. Next, I extracted total DNA from each of the fruit body samples, and determined nucleotide sequences of the cox3 region of mitochondrial DNA (mt cox 3) and the nuclear ribosome DNA ITS region (nrITS). In the case that individuals are composed of a particular DNA type of mt cox3, and this coincides with those of nrITS, reproductive isolation is suggested between the DNA types of mt cox3. In the course of the nrITS analysis, I actually found 30 individuals which had heterozygous sequences. The existence of heterozygotes suggests that individuals (primary hypha in higher fungi) with two different sequences can conjugate and thus, these sequences are conspecific. In this study, I determined each of the two sequences in the heterozygous individuals using the SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) method. In this study, 96 H. fasciculare fruit body samples were collected from 29 different localities. On molecular phylogenetic analysis of the fruit body samples, both the mt cox3 and nrITS regions demonstrated two molecular trees which constituted two different DNA types. The individuals which constituted each of the two DNA types basically coincided between the two DNA regions with different inheritance modes. The fruit body samples of the two DNA types were collected from the same localities where they were close enough to mate. Therefore, these two DNA types should not be geographical variants. Moreover, the results of SSCP analysis of the nrITS region demonstrated that the majority (28/30 individuals) of the heterozygotes contained two sequences of the same DNA type. This means that they were formed by mating between the two primary hyphas belonging to the same DNA type. These results suggest that mating within each DNA type occurs easily. However, two samples had both sequences of the two DNA types. By examining fertility research of these two fruit body samples, the spores of both the samples were deformed, suggesting that they are sterile hybrids. Therefore, I concluded that reproductive isolation exists between these two DNA types. Between the two DNA types, morphological and ecological differentiations were also observed. Individuals of one type (Type A) had a pileus of light to bright yellow color and a dull yellow lamella. By contrast, most of the individual of the other type (Type B) had a yellow brown pileus and dark purple lamella. In addition, microscope observations indicated that morphology of spores and cystidias, which are often used for morphological taxonomy of higher fungi, differed between the two DNA types. Moreover, the fruit bodies of Type A were found on very rotten wood and stumps, whereas those of Type B grew on less rotten woods but at the foot of stumps or stands of dead wood. From all these result, I concluds that H. fasciculare contained at least two cryptic species, which are reproductively isolated and also morphologically and ecologically differentiated.
首都大学東京, 2017-03-25, 修士(理学)
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