Thesis or Dissertation 大腸菌のヘム合成経路に関する遺伝学的解析

石川, 美咲

2015-03-25
Description
大腸菌で光合成細菌の光合成機能を再構成するために、当研究室では現在光合成に必要な色素であるバクテリオクロロフィルaの合成の再構成が進められている。先行研究により中間体の合成までは成功しているが、まだバクテリオクロロフィルaの合成には至っていない。バクテリオクロロフィルa合成は、大腸菌の電子伝達系などのタンパク質の補欠分子族であるヘムの合成中間体であるプロトポルフィリンIXを基質とするが、バクテリオクロロフィルaを合成させるためには光合成細菌の関連遺伝子群の導入に加えて、大腸菌のヘム合成経路を改変して基質を増大させることが有効ではないかと考えられる。しかし大腸菌のヘム合成経路のどの部分を改変すればプロトポルフィリンIXを増産させることができるのかについては分かっていなかった。またヘム合成経路そのものについても、関連遺伝子とされてきたhemX, Y遺伝子の機能が解明されていなかった。そこで本研究ではこれらの点を明らかにするために、ヘム合成経路に関与する遺伝子群の過剰発現株と高温感受性機能欠損株を用いて解析を行った。まずグルタミン酸から合成されるアミノレブリン酸からヘムを合成するのに必要なヘム合成遺伝子群の種々の過剰発現株について、合成される中間体の量をHPLCで調べた。その結果、hemB, C, D遺伝子群またはhemB, C, D, E遺伝子群を過剰発現させても中間体の合成量に顕著な変化は見られないが、hemF, N遺伝子を過剰発現させることにより、プロトポルフィリンIXの蓄積量が増大することがわかり、hemF, N遺伝子がヘム合成経路における律速段階であることがわかった。またhemX, Y遺伝子の機能について調べるために、hemY遺伝子、またはhemX, Y遺伝子を欠失させた株について調べたが、表現型はわからなかった。そこで他の一連のヘム合成関連遺伝子との高温感受性二重、三重、または四重変異株について調べたところ、hemE高温感受性欠失株にhemYまたはhemX, Y遺伝子の欠失変異を導入した菌株では、hemE欠失株で蓄積が認められた水溶性のウロポルフィリン関連物質の量が減少することがわかった。本研究によりヘム合成経路における律速段階が明らかになり、大腸菌のヘム合成経路の改変によるプロトポルフィリンIXの増産が可能になった。またヘム合成関連遺伝子とされてきたhemX, Y遺伝子の機能についても新たな知見が得られた。これらの成果により今後ヘム合成経路についての理解、さらにはバクテリオクロロフィルa合成の再構成が進むものと思われる。
In our laboratory, a project for reconstitution of bacteriochlorophyll a biosynthesis is in progress as a step to reconstitute the photosynthesis reactions of photosynthetic bacteria in Escherichia coli. The synthesis of bacteriochlorophyll a has not been observed although an intermediate, chlorophyllide a, was detected. Bacteriochlorophyll a is synthesized via protoporphyrin IX, which is the precursor of heme biosynthesis in E. coli. Heme is a prosthetic group of the proteins, which is essential for several cellular functions such as electronic transport in respiration. For reconstitution of bacteriochlorophyll a synthesis, it is necessary to increase protoporphyrin Ⅸ production. However, we have not enough knowledge about heme biosynthesis pathway. For example, we do not know which hem genes should be over-expressed. And there are uncharacterized genes, hemX and hemY, in the hem operon and these genes may affect protoporphyrin Ⅸ production. Therefore, I studied the heme biosynthesis pathway of E. coli. First, I analyzed the intermediates of the heme biosynthesis pathway of several strains, which over-expressed hem genes. The increased accumulation of protoporphyrin IX was observed in the strains having over-expressed hemF and/or hemN genes, but not in the strains having over-expressed hemB, hemC, and hemD, or hemB, hemC, hemD, and hemE genes. These results suggested that the hemF and hemN genes are rate-limiting step in the heme biosynthesis pathway. Next, I studied the function of the hemX and hemY genes. First I examined cell growth and intermediates of the heme biosynthesis of the hemY or hemX hemY deletion mutants, but I did not identify their phenotype. Then, I examined those intermediates of temperature-sensitive multiple depletion mutants of hem genes. The results indicated that an uroporphyrin-related material was accumulated in the hemE depletion strains and that the accumulation of this uroporphyrin-related material was reduced in the hemY hemE and hemX hemY hemE depletion strains. In this study, I found a key step of the heme biosynthesis pathway for increased production of protoporphyrin IX. And I found the phenotype of hemX hemY and hemY mutants and further analyses will clarify the functions of the hemX and hemY genes. These results will contribute reconstitution of bacteriochlorophyll a biosynthesis in E. coli.
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