学位論文 新規Sonic hedgehog経路の解明を目指した12回膜貫通タンパク質Patched1欠損細胞株の確立

関, 裕之

pp.1 - 72 , 2015-03-25
Sonic hedgehog (Shh)シグナル伝達経路では、細胞外分泌タンパク質Shhが12回膜貫通型受容体タンパク質Patchedlに結合することで、シグナルが核内へ伝達される。本経路はショウジョウバエからヒトに到るまで進化的に保存されており、初期発生における四肢や神経管の形成に重要な役割を果たすことが報告されている。近年、従来経路に加え、Patchedl第7細胞質ドメイン(ICD7)を介した新しいシグナル伝達経路の存在が明らかになってきた。以前より、ICD7をコードする遺伝子領域に、発癌性点変異が報告されている。さらに、ICD7はプロセシングを受け、生じた断片が核内に移行することや、ユピキチン化酵素をはじめとする種々のタンパク質と相互作用することも見出されつつある。このように、ICD7を介したシグナル伝達経路の重要性は示唆されているが、従来の研究は過剰発現系に依存しており、また内在性Patchedlの影響を排除することが困難であったため、充分な機能解析を行うことは不可能であった。そこで本研究では、近年、技術進展が著しいTALEN並びにCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集により、Patchedl遺伝子ノックアウト細胞株の樹立を目指した。まず私は、Patchedl遺伝子のexonl、exon2及びexon14領域に標的配列を持つTALEN発現ベクター、gRNA発現ベクターを作製し、それらが有効なDNA二重鎖切断活性を有することをSSAアッセイにより確認した。変異細胞株作出に際し、より高効率で導入が可能な非相同末端結合を利用した方法、スクリーニングがより容易な相同組み換えを利用した方法の2種類の手法を試みた。後者の方法においては、変異が導入された細胞を効率的に選択するために、Patchedl exon領域にピューロマイシン耐性遺伝子とEGFP遺伝子を導入するターゲティングベクターを用いた。これらのプラスミドを、Shhシグナル応答性が確認されているヒト胎児腎細胞(HEK293T)に導入し、内在性Patchedl遺伝子欠失細胞株の作出を試みた。限界希釈、ピューロマイシンを用いた薬剤スクリーニングの後、変異挿入の有無を確認するため、ゲノムDNAを鋳型として標的配列をPCR増幅し、それらの塩基配列解析を行った。その結果、TALENを導入し変異導入を試みた細胞では、Patchedl遺伝子のexon領域における変異導入は確認されなかった。一方、CRISPR/Cas9を用いた方法では、非相同末端結合を利用する方法によって、複数の細胞株において両対立遺伝子に変異が挿入されていることが確認された。さらに、相同組み換えを利用した手法においても、複数の細胞株において両対立遺伝子にピューロマイシン耐性遺伝子とEGFP遺伝子が挿入されていることが確認された。以上の結果から、CRISPR/Cas9を導入することで、Patchedl遺伝子ノックアウト細胞株の作出に成功した。今後、このPatchedl欠失細胞株を用いて、ICD7領域に種々の変異を導入したトランスジェニックラインを確立し、ICD7の機能的解明を進めることが期待される。
Sonic hedgehog (Shh) pathway is an evolutionally conserved signaling machinery from fruit-fly to human, and plays a pivotal role in cell growth, differentiation, and pattern formation in many multicellular organisms. In the traditional Shh pathway, Patchedl (Ptcl), a twelve-passed transmembrane domain receptor protein, binds to Shh via its extracellular domain and transfers a signal into the cell. Our previous study revealed that Ptcl-intracellular domain 7 (ICD7) is involved in a novel signaling pathway. Several oncogenic mutations are found in this region and therefore the findings suggested that the ICD7-mediated pathway plays a role in cell proliferation. The precise mechanism of ICD7-mediated signaling pathway, however, has not been elucidated yet. Although we analyzed the roles of ICD7 using overexpressed ICD7, it was difficult to clarify mechanisms and physiological roles of ICD7 due to the expression of endogenous Ptcl. In this study, I therefore attempted to establish a Ptcl knock out cell line to avoid influences of endogenous ICD7 using genome engineering techniques, TALEN and CRISPR/Cas9 system. First of all, I prepared TALEN and CRISPR/Cas9 expression vector targeting first, second and 14th exons of Ptcl. The activities of TALEN and CRISPR/Cas9 were measured by single strand annealing assay, and there with high activities were used in following steps. Double strand breaks induce DNA repairing pathways such as non-homologous end joining and homologous recombination (HR). Insertion or deletion of nucleotides are introduced during repair of DNA strands in the former pathway. On the other hand, single or multiple genes are introduced into at the target site in HR. In the latter case, I used targeting vector which codes puromycin resistant as well as EGFP genes as selection markers. After transfection of these plasmids in HEK293T cells that is known to respond to Shh signaling, limiting dilution analysis or drug screening were carried out. In order to confirm whether mutations were introduced or not, I carried out genomic PCR and DNA sequencing against exons of Ptcl. As a result, I was not able to establish any Ptcl knock out cell line using TALEN, while Ptcl knock out cell lines were established by using CRISPR/Cas9.


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