Thesis or Dissertation 大腸菌における光合成色素合成の再構成にむけた試み

岩崎, 航大

pp.1 - 39 , 2015-03-25
近年合成生物学的研究が盛んに行われるようになってきたが、ある生物の機能を他の生物で再構成することによって、その生物についての研究だけではわからなかったことが明らかになる可能性がある。当研究室では「光合成」という生物学的に重要な反応の、合成生物学的なアプローチによるメカニズムの解明を目指して、光合成細菌の光合成関連遺伝子群を大腸菌に導入することにより、大腸菌において光合成機能を再構成することを試みている。そのためにはまず光合成色素であるカロテノイドとバクテリオクロロフィルaを大腸菌に合成させることが必要であるが、先行研究によりカロテノイド、合成についてはすでに成功している。バクテリオクロロフィルa合成については、紅色光合成細菌Rubrivivax gelatinosusのバクテリオクロロフィルa合成関連遺伝子群を二種類のプラスミドにクローニングし、それらを組み合わせる事により少量ではあるが中間体であるクロロフィライドaを合成させることに成功している。そこで本研究では、バクテリオクロロフィルaの合成のためには、まずこのクロロフィライドaの合成量を増大させることが重要であると考え、それを目的として研究を行った。まず他の光合成関連遺伝子群がバクテリオクロロフィルa合成に重要である可能性を考え、バクテリオクロロフィルa合成関連遺伝子群の近傍に存在する光合成関連遺伝子をさらに導入した株を作製した。具体的には光捕集系や反応中心に関わる遺伝子群、またバクテリオクロロフィルa合成に必要な還元力を増強するためにフェレドキシンの遺伝子を導入した株を作製した。これらの菌を培養し細胞内で、蓄積するバクテリオクロロフィルa合成の中間体についてHPLCにより調べたが、顕著な変化は見られなかった。そこで次に培養方法についての検討を行った。培地、温度、培養時間について調べたところ、Antibiotic medium3培地で、30℃、24時間、定常期まで培養した時に、クロロフィライドaなどバクテリオクロロフィルaの中間体が最も多く蓄積することがわかった。また培地に種々の無機塩類を添加することの影響について調べたところ、興味深いことにMgS0₄、MgCl₂を培地に比較的高濃度加えることによって、クロロフィライドaなどの中間体の蓄積量がかなり増大することがわかった。本研究により、バクテリオクロロフィルa合成が培地のマグネシウムイオンの濃度により大きく影響を受けることが明らかになったが、今後さらに解析を進めそのメカニズムを解明することによって、光合成細菌内でのバクテリオクロロフィルa合成の新たな面が明らかになると思われる。
Reconstitution of a biological function in other organism is valuable approach. For example, necessary factors for the biological function can be identified in the original organism, but the reconstitution in other organism can be useful to know whether or not those are sufficient. In our laboratory, a project of synthetic biology for reconstitution of the photosynthetic reactions is in progress by introduction of the photosynthetic genes of photosynthetic bacteria into Escherichia coli cells to elucidate basic mechanism of the photosynthetic reaction. For reconstitution of the photosynthetic reaction, synthesis of carotenoid and bacteriochlorophyll a are essential. The carotenoid synthesis has been successfully reconstituted in our laboratory. For bacteriochlorophyll a synthesis, the photosynthetic genes of purple photosynthetic bacterium, Rubrivivax gelatinosus, were sequentially cloned into two multi-copy plasmids and these plasmids were introduced into E.coli. It was found that a small amount of an intermediate, chlorophyllide a, was synthesized. In this work, I tried to synthesize large amount of chlorophyllide a. First, I cloned other photosynthetic genes, which are necessary for the light harvesting complex, reaction center complex, and ferredoxin of R. gelatinosus, into the third plasmid and introduced them into the E. coli strain. But these resultant strains did not synthesize large amount of chlorophyllide a. Then, I examined the effects of culture condition, especially, culture medium, temperature, and time. The results showed that the E. coli strain should be incubated in the Antibiotic medium 3 at 30℃ for 24 hour. Furthermore, I examined the effects of addition of various inorganic salts into culture media. Interestingly, increase of accumulation of chlorophyllide a was observed by addition of rather high concentration of MgS0₄ and MgCl₂. These results suggested that magnesium ion of culture medium have affected on the synthesis of chlorophyllide a. Further analyses would be necessary to elucidate its mechanism and to show the importance of magnesium ion for the bacteriochlorophyll a synthesis even in the photosynthetic bacteria.

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